단백질 분석 방법 (쉽게 배우는 생화학 12)

생화학 방법에 의한 단백질의 초기 분석

 단백질의 기능은 물리적 구조에 의해 결정되기 때문에 분석 기술이 매우 다양합니다. 그중 기초적인 생물의 생화학 방법에 대해서도 설명해 드리겠습니다.

 

 

 

아미노산 성분

 단백질 분석의 첫 단계는 분자 내 각 아미노산 잔기의 수를 결정하는 것입니다. 아미노산성분의 정보는 모든 펩티드 결합을 완전히 가수분해하여 얻습니다. 단백질 가수분해는 6 N HCl로 10~100시간 처리합니다. 루신, 이소루신과 발린의 가수분해는 이보다 더 시간이 걸립니다. 그리고 가수분해 산물인 자유 아미노산 혼합물은 자동화된 이온-교환 크로마토그래피와 고압액상 크로마토그래피(HPLC, high-pressure liquid chromatography)를 사용하여 분석합니다.

 

 이온-교환 크로마토그래피를 사용할 경우 단백질 가수분해 산물을 양이온-교환수지의 칼럼에 처리합니다. 처음에는 산성 완충액(pH3)을 칼럼에 통과시킵니다. 대부분의 아미노산은 pH3에서 양전하를 띠기 때문에 결합된 양이온을 대신하여 음전하의 수지와 결합합니다. 따라서 음전하의 아미노산들이 제일 먼저 용출됩니다. 그리고 완충액의 pH와 이온의 세기가 증가하면서 다른 아미노산들이 칼럼으로부터 잇달아 나오게 됩니다. 칼럼으로부터 용출된 아미노산들을 정량적으로 분석합니다. 프롤린을 제외한 아미노산을 닌히드린(ninhydrin)으로 가열하면 보라색 생성물인 루헤만 자색(Ruhemann's purple)이 나타납니다. 프롤린의 경우에는 노란색을 나타냅니다. 각 아미노산의 농도는 색깔의 흡수도를 측정하여 계산합니다.

 

 HPLC의 경우 단백질 가수분해 산물을 에드먼(Edman) 시약으로 처리한 후 생성물을 고압 상태 하에서 칼럼에 주입합니다. 각 아미노산을 칼럼 상에 나타나는 정체시간(retention time)에 따라 동정합니다. 약 1시간 정도의 시간으로 아미노산 분석이 가능하기 때문에 HPLC 방법이 널리 이용되고 있습니다.

 

 

아미노산 서열 분석

 아미노산 서열을 규명하는 데에는 여러 단계의 실험이 필요합니다.

 

1. 모든 이황화 결합의 절단 - 과산화포름산에 의한 산화 반응 사용
2. Sanger방법을 통한 N-말단과 C-말단 아미노산의 결정
   • N-말단 아미노산 측정
     
     • 폴리펩티드를 1-플루오로-2,4-디니트로벤젠(1-fluoro-2,4-dinitrobenzene)으로 처리
     • N-말단 아미노산의 디니트로페닐(dinitrophenyl, DNP) 유도체를 분리 후 이온-교환 크로마토그래피 확인
   • C-말단 잔기 확인
     • 카르복시펩티다아제(carboxypeptidase) A와 B를 이용하여 결정
     • C-말단으로부터 한 번에 잔기 한 개씩 가수분해하므로 첫 아미노산이 C-말단 잔기
     • 카르복시펩티다아제 A: 방향족 아미노산이 C-말단 잔기일 때 펩티드결합을 우선적으로 분해
     • 카르복시펩티다아제 B: 염기성 아미노산 잔기 우선적 분해
3. 폴리펩티드의 펩티드 단편으로의 절단
   • 기술적 문제 때문에 긴 폴리펩티드의 아미노산서열의 직접 규명이 어려우므로 우선은 더 작은 크기로 나눔
   • 폴리펩티드를 여러 다른 부위에서 끊는 각종 화합물을 사용하면 중복된 펩티드 단편을 얻음
   • 각 단편의 아미노산서열의 결정을 토대로 폴리펩티드의 전체 서열 확인
   • 트립신: 리신 또는 아르기닌의 카복시 쪽의 펩티드 결합 분해
     = 트립신 펩티드는 리신 또는 아르기닌 카르복실 말단 잔기를 가짐
   • 키모트립신: 페닐알라닌, 티로신 또는 트립토판의 카르복실 쪽 펩티드 결합 분해
   • 브롬화시아노겐(cyanogen bromide): 메티오닌 잔기의 카르복실 쪽 펩티드 결합 분해
4. 펩티드 단편의 서열 결정
   • 각 단편의 서열은 에드먼 분해(Edman degradation)의 반복된 주기에 의해 결정
   • 페닐이소티오시안산(phenylisothiocyanate, PITC): 각 단편의 N-말단 잔기와 반응
   • PITC 처리 후 산처리하면 N-말단 잔기가 페닐티오하이단토인(phenylthiohydantoin) 유도체로 떨어져 나감
   • 전기영동 또는 HPLC를 사용하여 표준(ladder)과 비교
   • 보통 에드먼 분해는 서열분석기(sequenator) 사용
5. 펩티드 단편 순서의 결정
   • 두 개 또는 그 이상의 폴리펩티드 단편들의 아미노산서열 정보를 모으면 중복 단편(overlapping fragment) 조사 가능
   • 중복되는 부분들을 이용하여 전체 서열을 맞춤

 

분자량 결정

 단백질 분자량을 결정하는 데에는 겔-여과 크로마토그래피, SDS-PAGE와 초원심분리 등의 방법이 있습니다.

 겔은 분자여과체(molecular sieve)로 작용하기 때문에 용출부피와 분자량 사이에 직접적인 상관관계가 있습니다. 분자량을 측정하기 위해 겔-여과 크로마토그래피를 사용할 때 겔 칼럼을 주의 깊게 계산해야 합니다.

 

 단백질 분자량 측정을 위해 널리 사용하는 전기영동으로 음전하의 세제 SDS를 사용합니다. SDC-폴리아크릴아마이드겔 전기영동(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)에서 SDS는 단백질의 소수성 부위에 결합합니다. 그 결과 단백질은 변성화되고 막대 모양이 됩니다.
 이러한 효과는 이황화다리를 끊는 메르캅토에탄올(mercaptoethanol)에 의해 일어날 수도 있습니다. 대부분의 단백질은 분자량에 거의 비례하여 SDS와 결합하기 때문에 전기영동 중 SDS-처리 단백질들은 양극으로 이동하고 분자량의 크기에 따라 분리됩니다.

 

 단백질 분자량을 측정하는 데 초원심분리를 이용하는 방법도 있습니다. 초원심분리는 분자의 성분을 그 크기, 표면적과 상대밀도에 따라 분리합니다. 고원심력을 이용하여 단백질 같은 고분자의 분자질량을 측정할 수 있습니다. 분석초원심분리를 사용하여 원심력에 의한 단백질의 침강속도를 광학적으로 측정합니다. 

 

 

X-선 결정학

 단백질의 3차 구조 정보는 주로 X-선 결정학을 통해 얻습니다. 단백질 구조에서 결합거리가 약 15nm이므로 단백질 구조를 분석하는 데 필요한 전자파는 짧은 파장을 필요로 합니다. 가시광선은 생체 분자를 분석할 능력은 없지만, X-선은 매우 짧은 파장이므로 분석에 적절합니다.

 

 X선 결정학에서는 결정 표본을 X-선에 노출시킵니다. X-선을 결정에 쐬면 결정의 원자들에 의해 분산되는데, 이 회절이 사진감광판에 기록됩니다. 회절 패턴은 전자밀도 지도(electron density map)를 작성하는 데 쓰입니다. 이 지도를 컴퓨터 프로그램을 이용하여 수학적으로 3차원 영상으로 구성합니다.

 

 

이번 포스팅에서는 단백질의 분석방법 중 생물학적으로 접근하여 분석하는 방법에 대해 알아보았습니다.